Design of advanced polymer architectures by tuneable thermoresponsive LCST-UCST copolymers

Abstract

For advanced technical applications, the bio-inspired development of modern materials is of great importance and is inter alia encouraged by the discovery of liquid-liquid phase transitions, as main driving force for molecular structure formation of membrane-less organelles in living organisms. Motivated by this background, the present thesis is dedicated to the molecular design of advanced, modular polymer architectures based on versatile, thermoresponsive copolymer systems, bearing tuneable miscibility gaps in aqueous media in consequence of their lower or upper critical solution temperatures (LCST/UCST). These responses serve as external trigger to dynamically change “on-demand” the solvation properties of the macromolecular building blocks, which were exploited for several innovative applications in this thesis: (a) complex solution behaviours of dual-thermoresponsive LCST-UCST block copolymers, (b) characterization of thermally switchable membranes, (c) control of dynamic coordination structures in aqueous solution by thermoresponsive macromolecular coordination ligands and (d) non-viral copolymer vectors for gene delivery. For this purpose, the LCST polymer poly(N-isopropyl acrylamide) (poly(NIPAAm)) and UCST analogue poly(acrylamide-co-acrylonitrile) (poly(AAm-co-AN)) are introduced as basic thermoresponsive systems, whose contrary solvation behaviours in aqueous polymer solutions are attributed by sharp and robust transitions, which can be monitored by turbidity measurements of their cloud points (Tc). The herein presented macromolecular structures are functionally designed by the choice of specific comonomers and were realized by the reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, which allows the fabrication of defined building blocks with variable end groups, controlled architectures and tuneable thermoresponsiveness. The UCST system of poly(AAm-co-AN) was thoroughly studied to gain accurate knowledge about the prediction of the copolymer’s thermoresponsive properties in free and controlled radical polymerization giving access to the subsequent research fields. In contrast to the literature, in which polar DMSO with high boiling point is used as solvent, the copolymer was synthesized in a mixture of water and 1,4-dioxane in order to simplify the common time-consuming purification (dialysis). Therefore, the polymerization parameters in terms of conversion and monomer incorporation were determined for the new reaction mixture in dependence of the reaction time to guarantee a suitable copolymerization behaviour of the monomers acrylamide (AAm) and acrylonitrile (AN). For the copolymers, the Tc could be synthetically adjusted by the choice of the proper acrylonitrile fraction in the monomer feed. An additional terpolymerization with the monomer N-(4-benzoylphenyl) acrylamide (BPAAm) provided access to the fabrication of photo-crosslinkable copolymers, which could be either covalently attached to surfaces or transformed to hydrogels by intramolecular network formation via subsequent irradiation with UV light. These entire study results in an accurate prediction for the adjustment of desired cloud point temperatures within the copolymerization of AAm, AN and BPAAm, tremendously improving the applicability of this copolymer system. The already extensively-studied LCST system of poly(NIPAAm) was employed as robust thermoresponsive counterpart, which was copolymerized with BPAAm and hydrophilic comonomers to yield linear photo-crosslinkable copolymers with appropriate transition temperatures, enabling the subsequent fabrication of responsive hydrogels. These two main polymer systems were modified for the use in the following four application fields. In the first research field, the contrary thermoresponsive systems above were combined in a dual-thermoresponsive LCST-UCST block copolymer by pursuing the sequential RAFT copolymerization pathway. This novel system of poly[(AAm-co-AN)-block-NIPAAm]-EMP showed a complex solvation behaviour in aqueous solution dependent to the adjustable hydrophobicity of its UCST block. While the thermoresponsiveness in previously reported systems is explained on basis of the simple behaviour of a homopolymer chain, here the analysis of the complex interdependent phase transitions also includes the intramolecular influence between both thermoresponsive blocks and their particular solvation state. The marked shift of the transition temperatures, when comparing the homoblocks with the corresponding block copolymers, is caused by the abrupt changes in the hydrophilicity during the coil-to-globule transitions for each block and therefore depends on the thermal history (heating or cooling cycle). Thus, the double-thermoresponsive copolymers were characterized with respect to their thermal behaviours, aggregate dimensions and calorimetric transitions via UV-Vis turbidity measurements, dynamic light scattering (DLS), and modulated differential scanning calorimetry (MDSC). The second application demonstrated a successful combination of anodized aluminium oxide substrates (AAO) with thermoresponsive copolymers for the fabrication of thermally switchable nanopore membranes, to investigate reversibly alterable diffusion processes through nanoscopic channels by the external stimulus of temperature. While the inner pore surface of reported systems is usually functionalized with polymers via ATRP, here linear RAFT copolymers of characterized composition and thermoresponsiveness are deposited in adjustable quantities from solution, before they are photo-immobilized as hydrogels in the pores and forming highly defined membranes. The copolymer mass of the filling was quantified in thermogravimetric measurements with dynamic heating rate, while the thermoresponsive switching states in aqueous solution (in form of LCST transitions) could be evidenced inside the nanopores by MDSC for the first time. In a third application, the reversible switchability of responsive polymer systems is married with the convenience of assembling highly defined molecular scaffolds by complexation of metal ions with specifically tailored ligands. Novel macromolecular coordination ligands (MCLs) with LCST (published as: https://doi.org/10.1039/D1PY00847A) or UCST character in aqueous media have been designed by conjugation of thermoresponsive polymer systems poly(NIPAAm) or poly(AAm-co-AN) with 1,2,4-triazole coordination sites. These triazole units were integrated via the RAFT method into two fundamentally different MCL architectures following two synthetic strategies: (I) The customized chain transfer agent 1-{[3-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)propyl]amino}-2-methyl-1-oxopropan-2-yl dodecyl carbonotrithioate (DMP-APTRZ) was employed for hemi-telechelic MCLs with a single triazole end group. (II) A tailored comonomer N-[3-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)propyl] methacrylamide (APTRZMAAm) provides access to multidentate MCLs with a controllable number of triazole side groups along the polymer backbone. The thermally controlled variation of the MCL volume demand was exploited for reversible aggregate formation upon Fe2+ complexation with respect to their chain state in aqueous solution driven by the LCST or UCST behaviour. Thermal response was studied via UV-Vis turbidity measurements, aggregate dimensions were determined via DLS, while the aggregate morphology was analysed via customized transmission electron microscopy (TEM). Finally, the copolymer system of AAm/AN was utilized for the first time in the scope of gene delivery research as basis of polycationic, non-viral vectors with UCST character. The RAFT methodology is suitable for the preparation of variable vector designs with a controlled integration of pDNA binding sites via the copolymerization with the known comonomer N-(3-aminopropyl) acrylamide (APAAm) to introduce free amine side groups to the polymer backbone. In contrast to the literature, which focuses on LCST polymers as thermoresponsive base, here the contrary thermoresponsivness of UCST vectors allows the reverse switching of the solvation states from hydrophobic to hydrophilic chain behaviour in aqueous media upon external temperature stimuli, leading to dynamic interactions between vector and pDNA. Those synthesized vectors demonstrated marked abilities to complex pDNA and further transfect several cell strains (C2C12, A549 and HeLa) in strong dependence of their molecular composition and skeletal architecture: In the latter, the APAAm units were either distributed (I) randomly, (II) as concise end block, or (III) as hybrid-structure along the macromolecular chain.

Für fortgeschrittene technische Anwendungen ist die bio-inspirierte Entwicklung moderner Materialien von großer Bedeutung und wird unter anderem durch die Entdeckung von Flüssig-Flüssig-Phasenübergängen als Hauptantriebskraft für die molekulare Strukturbildung membranloser Organellen in lebenden Organismen bestärkt. Von diesem Hintergrund motiviert, widmet sich die vorliegende Dissertation dem molekularen Design fortschrittlicher, modularer Polymerarchitekturen thermoresponsiver Copolymer-Systeme, die durch ihre kritischen unteren oder oberen Lösungstemperaturen (engl.: LCST/UCST) justierbare Mischungslücken im wässrigen Medium aufweisen. Dieses Verhalten dient als äußerer Impuls, um die Solvatationseigenschaften der makromolekularen Bausteine „nach Bedarf“ dynamisch zu ändern, die in dieser Arbeit für mehrere innovative Anwendungen genutzt wurden: (a) komplexes Lösungsverhalten von zweifach-thermoresponsiven LCST-UCST-Blockcopolymeren, (b) Charakterisierung thermisch-schaltbarer Membranen, (c) Kontrolle dynamischer Koordinationsstrukturen in wässriger Lösung durch thermoresponsive, makromolekulare Koordinationsliganden und (d) nicht-virale Copolymervektoren im Zuge des Gentransfers. Zu diesem Zweck werden das LCST-Polymer Poly(N-isopropylacrylamid) (poly(NIPAAm)) und das UCST-Analogon Poly(acrylamid-co-acrylnitril) (poly(AAm-co-AN)) als grundlegende thermoresponsive Systeme vorgestellt, deren konträre Solvatationsverhalten in wässrigen Polymerlösungen scharfe und intensive Übergänge (engl.: Tc) aufweisen, die durch Trübungsmessungen ihres Phasenverhaltens beobachtet werden können. Die hier vorgestellten makromolekularen Strukturen wurden durch die Wahl spezifischer Comonomere konzipiert und durch die reversible Additions-Fragmentierungs-Kettentransfer-Polymerisation (engl.: RAFT polymerization) realisiert, welche die Herstellung definierter Bausteine mit variablen Endgruppen, kontrollierten Architekturen und einstellbarer Thermoresponsivität ermöglicht. Das UCST-System Poly(AAm-co-AN) wurde tiefergehend untersucht, um genaue Kenntnisse über die Vorhersage der thermoresponsiven Eigenschaften des Copolymers in der freien und kontrollierten Radikalpolymerisation zu gewinnen und Zugang zu den nachfolgenden Forschungsgebieten zu gewähren. Im Gegensatz zur Literatur, in der als Lösungsmittel polares DMSO mit hohem Siedepunkt verwendet wird, wurde das Copolymer in einer Mischung aus Wasser und 1,4-Dioxan synthetisiert, um die übliche zeitaufwendige Reinigung (Dialyse) zu verkürzen. Daher wurden die Polymerisationsparameter hinsichtlich des Umsatzes und des Monomer-Einbaus in Abhängigkeit der Reaktionszeit für das neue Reaktionsgemisch bestimmt, um ein geeignetes Copolymerisationsverhalten der Monomere Acrylamid (AAm) und Acrylnitril (AN) zu gewährleisten. Bei den Copolymeren konnte der Tc durch die Wahl des passenden Acrylnitril-Gehaltes in der Einwaage der Monomere synthetisch eingestellt werden. Eine zusätzliche Terpolymerisation mit dem Monomer N-(4-Benzoylphenyl)acrylamid (BPAAm) ermöglichte die Herstellung von photo-vernetzbaren Copolymeren, die entweder kovalent an Oberflächen gebunden oder durch intramolekulare Netzwerkbildung mit anschließender UV-Bestrahlung in Hydrogele umgewandelt werden konnten. Diese Gesamtheit der synthetischen Studien erlaubte die Herleitung einer genauen Vorhersage zur Einstellung gewünschter Trübungspunkttemperaturen bei der Copolymerisation von AAm, AN und BPAAm, wodurch die Anwendbarkeit dieses Copolymersystems enorm gesteigert werden konnte. Das bereits umfassend untersuchte LCST-System Poly(NIPAAm) wurde als robustes, thermoresponsives Analogon verwendet, welches mit BPAAm und hydrophilen Comonomeren copolymerisiert wurde, um lineare photo-vernetzbare Copolymere mit adäquaten Übergangstemperaturen zu synthetisieren und die anschließende Herstellung von responsiven Hydrogelen zu ermöglichten. Diese zwei Polymersysteme wurden für den Einsatz in den folgenden vier Anwendungsgebieten modifiziert. Im ersten Forschungsgebiet wurden die oben genannten gegensätzlichen thermoresponsiven Systeme in einem zweifach-thermoresponsiven LCST-UCST-Blockcopolymer kombiniert, indem eine sequentielle RAFT-Copolymerisation verfolgt wurde. Dieses neuartige System poly[(AAm-co-AN)-block-NIPAAm]-EMP zeigte ein komplexes Solvatationsverhalten in wässriger Lösung in Abhängigkeit der einstellbaren Hydrophobie seines UCST-Blocks. Während die Thermoresponsivität in zuvor berichteten Systemen auf der Grundlage des einfachen Verhaltens einer Homopolymerkette erklärt wird, umfasst die vorliegende Analyse der komplexen voneinander abhängigen Phasenübergänge auch den intramolekularen Einfluss zwischen den beiden thermoresponsiven Einzelblöcken und ihrem jeweiligen Solvatationszustand. Die deutliche Verschiebung der Übergangstemperaturen beim Vergleich zwischen Homoblock und des entsprechenden Blockcopolymers zeigt, dass während der Knäuel-Globuli-Übergänge eine abrupte Änderung der Hydrophilie für jeden Block verursacht wird, weswegen sie daher von der thermischen Vorgeschichte abhängt (Heiz- oder Kühlzyklus). So wurden die doppelthermoresponsiven Copolymere hinsichtlich ihres thermischen Verhaltens, ihrer Aggregatdimensionen und kalorimetrischen Übergänge durch UV-Vis-Trübungsmessungen, dynamischer Lichtstreuung (engl.: DLS) und modulierte Differenzkalorimetrie (eng.: MDSC) untersucht. Die zweite Anwendung stellte eine erfolgreiche Kombination von anodisierten Aluminiumoxidsubstraten (AAO) mit thermoresponsiven Copolymeren zur Herstellung von thermisch schaltbaren Nanoporenmembranen dar, um reversibel veränderbare Diffusionsprozesse durch nanoskopische Kanäle durch den externen Temperaturreiz zu untersuchen. Während die innere Porenoberfläche der beschriebenen Systeme normalerweise mit Polymeren über ATRP funktionalisiert wird, werden hier lineare RAFT-Copolymere, charakterisierter Zusammensetzung und Thermoreaktion, in gewünschten Mengen aus Lösung abgeschieden, bevor sie als Hydrogele in den Poren photo-immobilisiert werden und hochdefinierte Membranen bilden. Die Copolymer-Masse der Füllung wurde in thermogravimetrischen Messungen mit dynamischer Heizrate quantifiziert, während die thermoresponsiven Schaltzustände in wässriger Lösung (in Form von LCST-Übergängen) erstmals innerhalb der Nanoporen durch MDSC nachgewiesen werden konnten. In einer dritten Anwendung wird die reversible Schaltbarkeit responsiver Polymersysteme mit der Bequemlichkeit des Aufbaus hochdefinierter molekularer Gerüste durch Komplexierung von Metallionen mit speziell zugeschnittenen Liganden kombiniert. Neuartige, makromolekulare Koordinationsliganden (engl.: MCLs) mit LCST- oder UCST-Charakter im wässrigen Medium wurden durch Konjugation der thermoresponsiven Polymersysteme Poly(NIPAAm) (veröffentlicht als: https://doi.org/10.1039/D1PY00847A) oder Poly(AAm-co-AN) mit 1,2,4-Triazol-Koordinationsstellen versehen. Diese Triazol-Einheiten wurden über die RAFT-Methode in zwei grundlegend unterschiedliche MCL-Architekturen mittels zweier Synthesestrategien integriert: (I) Ein modifiziertes Kettenübertragungsmittel 1-{[3-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)propyl]amino}-2-methyl-1-oxopropan-2-yl-dodecylcarbonotrithioat (DMP-APTRZ) wurde für hemi-telechele MCLs mit einer einzelnen Triazol-Endgruppe verwendet. (II) Ein maßgeschneidertes Comonomer N-[3-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)propyl]methacrylamid (APTRZMAAm) bietet Zugang zu mehrzähnigen MCLs mit einer kontrollierbaren Anzahl von Triazol-Seitengruppen entlang des Polymerrückgrats. Die thermisch-kontrollierte Variation des MCL-Volumenbedarfs wurde für eine reversible Aggregatbildung genutzt, bei der die Fe2+-Komplexierung in Abhängigkeit von ihrem Kettenzustand in wässriger Lösung durch das LCST- oder UCST-Verhalten gesteuert werden konnte. Das thermische Verhalten wurde durch UV-Vis-Trübungsmessungen untersucht, während die Aggregatabmessungen mittels DLS und die Aggregatmorphologie mittels individueller Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) analysiert wurde. Schließlich wurde das Copolymersystem aus AAm/AN erstmals im Rahmen der Gentransfer-Forschung als Basis polykationischer, nicht-viraler Vektoren mit UCST-Charakter genutzt. Die RAFT-Methodik eignet sich für die Herstellung eines variablen Vektordesigns mit einer kontrollierten Integration von pDNA-Bindungsstellen über die Copolymerisation mit dem bekannten Comonomer N-(3-Aminopropyl)acrylamid (APAAm), um freie Amin-Seitengruppen in das Polymerrückgrat einzuführen. Im Gegensatz zur Literatur, welche sich ausschließlich auf LCST-Polymere als thermoresponsive Grundlage fokussiert, ermöglicht hier die gegenteilige Thermoresponsivität von UCST-Vektoren das umgekehrte Umschalten der Solvatationszustände von hydrophobem zu hydrophilem Kettenverhalten im wässrigen Medium bei externen Temperaturstimuli, was zu dynamischen Wechselwirkungen zwischen Vektor und pDNA. Diese synthetisierten Vektoren zeigten beachtliche Fähigkeiten, pDNA zu komplexieren und diverse Zellstämme (C2C12, A549 und HeLa) in starker Abhängigkeit ihrer molekularen Zusammensetzung und Skelettarchitektur zu transfizieren: In letzterer waren die APAAm-Einheiten entweder (I) zufällig (II) als definierter End-Block, oder (III) als beider Hybridstruktur entlang der makromolekularen Kette verteilt.